Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Interessante Versuche aus der Biologie, Biochemie und Biotechnologie.

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Alf
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Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von Alf »

Auch wenn dieser Artikel wieder mehr in dem Bereich Biologie passt geht es doch um eine Vielzahl chemischer Substanzen und Verfahren mit denen es gelingt neuronale Strukturen selektiv darzustellen. Dadurch wurde Ende des 19. Und Anfang des 20. Jahrhunderts die Erforschung des zentralen Nervensystems bzw. seiner Faserverbindungen im Wesentlichen ermöglicht. Sie bilden die Grundlage für das Verständnis der modernen Neuroanatomie und sind ein gutes Beispiel für relativ einfache histochemische Verfahren. Die (Immun-)histochemie spielt vor allem in der Tumordiagnostik eine immer größer werdende Rolle zur exakten Beschreibung von Tumorzellmerkmalen. Dies ist ein wichtiger Grundstein um in Zukunft Patient/Innen personalisierte Medizin anbieten zu können.

In diesem Artikel möchte ich relativ spezielle Methoden der Neurohistologie/-anatomie vorstellen und wie diese auch auf Amateurniveau relativ einfach umgesetzt werden können. Diese Methoden sind im Internet teilweise als sehr kompliziert/empfindlich beschrieben. Die hier verwendeten Rezepte sind aus den unten angegebenen Quellen (1-8) tlw. modifiziert und liefern zuverlässige Ergebnisse. Damit können Nervenzellen und Axone in den verschiedenen Abschnitten des ZNS gut untersucht und veranschaulicht werden. Neurohistologische Methoden waren wegweisend in der Erforschung und Beschreibung diverser neuroanatomischer Faser- und Kernsysteme. Die einzelnen später abgebildeten Gehirnregionen werden in ihrer Funktion nur oberflächlich beschrieben.
Diese Methoden sind nicht nur auf das Nervensystem von Säugetieren beschränkt, damit kann man auch zentralnervöse Strukturen in anderen Tiergruppen untersuchen und Faserverbindungen darstellen (z.B. Essigfliege – Drosophila melanogaster).
Zur Darstellung der Neurofibrillen werden die Bielschowsky Färbung und Bodian Färbung vorgestellt. Diese Färbemethoden waren wegweisend in der Entdeckung von Fasersystemen und deren Zuordnung im Hinblick auf funktionelle Verschaltungen.
Ebenfalls soll die Weil Färbung vorgestellt werden, welche die Differenzierung zwischen myelinisierten und unmyelinisierten Fasern erlaubt.


Materialien:

Schweinegehirn (möglichst frisch und ganz vom Schlachter am besten inkl. Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark), Essigfliegen, Skalpell, Petrischalen, Kunststoffgefäß, Bechergläser, Wärmschrank, einstellbare Heizplatte, Mikrotom, Objektträger, Deckgläser, Mikroskop, Pinzetten, Pipetten.


Methodik:

Im Endeffekt müssen histologische Schnitte durch die präparierten Gewebe hergestellt werden. Dazu verweise ich im Detail auf meine vorherige Darstellung (viewtopic.php?t=5037), wobei ich in diesem Protokoll einige Abänderungen vorgenommen habe. Die Entwässerung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Dazu müssen die einzelnen Schritte länger erfolgen, pro Alkoholstufe ca. 3 Stunden, im Ethanol 96 % und Isopropanol und n-Butanol jeweils 4 Stunden mit je 2x Wechsel. Das langsamere Entwässern bei Raumtemperatur hat bei ZNS Gewebe den Vorteil weniger Schrumpfungsartefakte zu verursachen, insbesondere im Kleinhirn.

In allen Schritten und Lösungen darf ausschließlich destilliertes Wasser verwendet werden!


Chemikalien:

Formaldehyd 8 % in 0,9 % NaCl Warnhinweis: attnWarnhinweis: xn

Ethanol 96 % Warnhinweis: f

Isoporpanol Warnhinweis: f

n-Butanol Warnhinweis: fWarnhinweis: cWarnhinweis: attn

Silbernitrat Warnhinweis: oWarnhinweis: cWarnhinweis: n

Gold(III)chlorid-Lösung 2 % (in den Rezepten entsprechend verdünnt) Warnhinweis: cWarnhinweis: attn

Natriumthiosulfat

Ammoniak 25 % Warnhinweis: cWarnhinweis: attn

Hydrochinon Warnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: cWarnhinweis: n

Oxalsäure Warnhinweis: attnWarnhinweis: c

Eisessig Warnhinweis: cWarnhinweis: f

Silberprotein (Protargol) / Albumosesilber Warnhinweis: attnWarnhinweis: n

Kupfer als Draht oder Folie

Ammoniumeisen(III)-sulfat Warnhinweis: c

Kaliumhexacyanidoferrat(III) Warnhinweis: attnWarnhinweis: n

Hämatoxylin Warnhinweis: attn

Kaliumiodat Warnhinweis: attnWarnhinweis: o


Sicherheitshinweise:

Beim Arbeiten mit Formaldehyd während der Gehirnfixierung unbedingt auf gute Lüftung achten, im Freien oder unter dem Abzug arbeiten. Auch Xylol und Butanol Dämpfe sind gesundheitsschädlich.
Ammonialkalische-Silbernitrat Lösung keinesfalls lagern, Entsorgung am besten direkt durch Eingießen in einen großen Überschuss Ascorbinsäure-Lösung, wobei sich sofort Silber abscheidet, welches später nach Auswaschen einfach recycelt werden kann.


Versuchsdurchführung:

a) Vorbereitung des Gewebes und Anfertigung der Schnitte:
Das Frische Schweinegehirn ist sehr zerfließlich weshalb es vorsichtig angefasst werden muss um keine Strukturen zu zerstören. Meistens bekommt man mehrere Hemisphären (manche besser manche schlechter je nach Bestellung und Kompetenz des Entnehmers). Die Hemisphären werden in ein großes Kunststoffgefäß gelegt und mit einer Lösung von 8 % Formalin und 0,9 % NaCl in 20%igem Ethanol übergossen. Das Formalingemisch sollte je nach Menge des Schweinegehirns ca. 2-mal gewechselt werden alle 24 Stunden. Die Gesamtfixierzeit betrug 3 Tage um ein ausreichendes Eindringen des Formalins zur gewährleisten. Dabei härtet das Gewebe aus und kann später leichter verwendet werden. Im Anschluss wurde das Formalin durch 40%iges Ethanol ersetzt. Das Ganze wurde mehrmals ausgewaschen, sodass nach 2 Tagen und 2 Wechsel mit 40%igem Ethanol das meiste Formalin aus dem Gewebe entfernt werden konnte und bereits eine milde Vorentwässerung erreicht wurde. Im Anschluss erfolgte das 2-malige Auswaschen mit 80%igem Isopropanol nach jeweils 24 Stunden. Dadurch lässt sich eine schrittweise Entwässerung erzielen, das Formaldehyd wird Großteils ausgewaschen und das Gewebe ist bereits teilweise etwas Entwässert. Die Gewebsstücke können auch im 80%igem Isopropanol für lange Zeit aufbewahrt werden. Bei Aufbewahrung in 100%igem Isopropanol/Ethanol härtet das Gewebe zu stark aus und kann nach einiger Zeit nicht mehr bzw. schlechter verarbeitet werden. Isopropanol ist zur Lagerung Ethanol generell vorzuziehen, da es zu einer geringeren Härtung führt.

Zur Fixierung von Insekten (Stubenfliege, Obstfliege) einet sich ein Gemisch aus Ethanol/Aqua dest./Formalin 20 %/Ameisensäure im Verhältnis 7:2:1:1 für 24 Stunden. Es empfiehlt sich das Caput vom Thorax zu trennen, dadurch ist auch ein besseres Eindringen der Entwässerung durch die vergleichsweise dicke Chitinschicht bei Insekten gewährleistet. Vor Entwässerung sollte die in den Tracheen der Insekten vorhandene Luft in einem Rundkolben mit 30%igem Ethanol und Wasserstrahlvakuum entfern werden.

Im Anschluss kann das Schweinegehirn seziert und interessante Strukturen herauspräpariert werden. Das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirnstamm, das Rückenmark und der Hippocampus lassen sich durch Hilfe mittels online auffindbarer Anatomie Skizzen und nach Orientierung meist einfach herauspräparieren.

Die so gewonnen Gewebsteile wurden zugeschnitten und wie im Methodik Teil beschrieben langsam entwässert, wobei man vom 80%igem Isopropanol über 3 Stufen 100%igem Isopropanol und 2 Stufen n-Butanol bei Raumtemperatur zu jeweils 6 Stunden schließlich in Paraffin eingebettet kann. Das Paraffin wird bei ca. 55 °C 3-mal gewechselt, die ersten 2 Stufen zu 6 Stunden, die letzte Paraffinstufe zu 12 Stunden. Im Anschluss kann ausgegossen und ausgehärtet werden und Paraffinblöcke angefertigt werden. Diese können auch Jahre später noch problemlos weiterverarbeitet werden.

Im Anschluss werden ca. 8-10 µm dünne Schnitte (nicht zu dünn da sonst die Fasersysteme nicht so gut abgebildet werden) angefertigt und auf Glycerin-Gelatine beschichtete Objektträger (am unteren Ende!) aufgelegt, mit einer Pipette vorsichtig mit etwas destilliertem Wasser unterspritzt, sodass der gesamte Paraffinschnitt von Wasser umgeben ist (aber nicht zu viel) und im Anschluss auf der ca. 48 °C warmen Wärmeplatte vorsichtig aber vollständig gestreckt. Schnitte durch ZNS Strukturen gelingen in aller Regel vollkommen problemlos. Das Schneiden von Insekten ist auf Grund des harten Chitinpanzers oft schwierig. Das Paraffin der Schnitte sollte beim Strecken glasig werden aber nicht schmelzen da es sonst zu Zerreißungen kommen kann. Das ZNS-Gewebe hält zwar gut zusammen aber vor allem bei den Schnitten im Cerebellum und Hippocampus und bei Insekten können sich relativ einfach Risse bilden und die Strukturen zerfließen. Die Objektträger werden dann schräg gestellt sodass überschüssiges Wasser ablaufen kann, Luft getrocknet und sind nach ca. 6 Stunden zur weiteren Verarbeitung bereit. Schnitte durch das ZNS von Insekten sollten dünner, ca. 4 µm geschnitten werden, da dickere Schnitte sehr leicht vom Objektträger abdiffundieren. Die schlechte Anheftung bei histologischen Untersuchungen von Insekten ist ein bekanntes und schwer lösbares Problem, da der starre Chitinpanzer kaum am Objektträger haften bleibt. Eventuell kann man sich durch teure, schwer beschaffbare, speziell beschichtete Objektträger behelfen. Auch das Schneiden von Insekten ist schwer, da der harte Chitinpanzer durch die Entwässerung spröde wird und zerbröselt. Essigfliegen haben sehr dünne Chitinpanzer und lassen sich dadurch relativ problemlos verarbeiten. Für alternative Insektenhistologie empfehlen sich spezielle Kunststoffeinbettungen.

Im Anschluss werden die Schnitte nochmals kurz auf die 90 °C heiße Wärmplatte gelegt um die Gewebsanteile möglichst mit der Glycerin-Gelatine zu verbinden, wobei das Paraffin jetzt schmelzen darf (wenn kein Wasser mehr dabei ist besteht keine Gefahr des Auseinanderdiffundieren der Schnitte). Im Anschluss erfolgen das Entparaffinieren über 2-mal Xylol, 1x n-Butanol, 1x Isopropanol, 1x Ethanol 96%, 1x Ethanol 50% und anschließend dest. Wasser, 3-mal gewechselt.

Alle im Anschluss genannten Verfahren werden ausgehend vom oben beschriebenen Protokoll weiterverarbeitet.


b) Silberimprägnation n. Bielschowsky(1,2-4)

Es wird eine feuchte Kammer in einer Petrischale vorbereitet. Dazu wird der Boden der Petrischale mit Küchen-/Toilettenpapier ausgelegt und mit dest. Wasser befeuchtet. Der Objektträger wird aus dem dest Wasser genommen und oberhalb des Schnittes wird mit einem alten Paraffinblock eine Grenze gezogen (das verhindert die Ausbreitung und das verlaufen der Silbernitratlösung). Der Objektträger wird im Anschluss so eingelegt, dass er leicht schräg nach unten in Richtung des Schnittes abfällt. Im Anschluss wird der Schnitt mit 20%iger Silbernitratlösung überschichtet, der gesamte Schnitt soll schön bedeckt sein, verwendet man zu viel, oder liegt der Objektträger zu schräg in der feuchten Kammer besteht die Gefahr, dass das Silbernitrat abläuft. Die Im Voraus gesetzte Paraffinteillinie verhindert ein Verlaufen der Silbernitratlösung nach oben. Im Anschluss wird die Feuchte Kammer geschlossen und mit einem Kartondeckel vollständig lichtgeschützt bedeckt und 3 Stunden an einem erschütterungsfreien Ort stehen gelassen.

Im Anschluss wird die Silbernitrat Lösung in ein Reagenzglas abgegossen, der Schnitt zügig (max. kurz eintauchen/wenige Sekunden) durch dest. Wasser gezogen und für 5 Minuten in eine Lösung aus 5 ml Formalin 20 %, 10 ml Ethanol und 35 ml Wasser eingestellt und vorsichtig hin- und herbewegt (dadurch verhindert man störende Niederschläge ein bisschen), der Schnitt färbt sich jetzt maximal hellbraun.
Währenddessen wird die abgekippte Silbernitrat Lösung solange vorsichtig mit Ammoniak Lösung versetzt, sodass sich der Niederschlag gerade wieder auflöst (nimmt man zu wenig erhält man später Niederschläge, nimmt man zu viel misslingt die Färbung oder fällt zu schwach aus).
Danach wird der Schnitt kurz in 10%iges Ethanol eingestellt und abgespült. Danach wird der Schnitt wieder in der feuchten Kammer leicht schräg gelegt und für 2-3 Minuten mit der ammoniakalischen-Silbernitrat Lösung überschichtet.

Danach wird der Schnitt kurz durch dest. Wasser gezogen und im Anschluss wieder für 3-5 Minuten die obige Lösung aus 5 ml Formalin 20 %, 10 ml Isopropanol und 35 ml Wasser eingestellt. Jetzt färbt sich der Schnitt dunkelbraun. Im Anschluss in dest. Wasser für 5 Minuten einstellen und mehrmals wechseln.
  • Variante A: über aufsteigende Alkoholreihen und Xylol entwässern und mit Malinol/Histokitt eindecken.
  • Variante B: Überschichten der Schnitte mit einer 0,2%igen Gold(III)chlorid Lösung für ca. 2 Minuten. Die Braunfärbung geht jetzt in ein grau-violett über (die Goldchlorid Lösung kann in ein Reagenzglas abgegossen und mehrfach verwendet werden auch wenn es nur ein paar Tropfen sind zahlt sich das aus). Danach kurz mit Aqua dest. waschen und dann für 5 Minuten in 5%ige Natriumthiosulfat Lösung einstellen, wieder in Aqua dest. Waschen, mehrmals wechseln und dann über aufsteigende Alkoholreihe über Xylol entwässern und mit Malinol/Histokitt eindecken.

c) Silberimprägnation n. Bodian (1,3-6)

Zur Vorbereitung müssen die Schnitte mind. 12 Stunden in 5%ige Essigsäure gestellt werden, damit eine Mitfärbung des Bindegewebes verhindert wird.
Im Anschluss wird die 1%ige Bodian Lösung hergestellt, indem das Protargol in einem Becherglas auf 35 °C warmes dest. Wasser gestreut wird. Im Dunkeln wartet man bis sich das Pulver abgesetzt und zu einem großen Teil gelöst hat (ca. 10 Minuten). Erst dann darf es geschüttelt oder gerührt werden. Im Anschluss wird die Protargol Lösung in ein Tablettenglas gefüllt und pro 100 ml ca. 4 g metallisches Kupfer in Form von Schnipseln aus einem Kupferkabel zugefügt. Danach werden die Objektträger eingestellt, das Gefäß mit Alufolie lichtdicht verpackt und für 24 Stunden bei 37 °C im Wärmeschrank belassen.
Im Anschluss werden die Objektträger kurz in dest. Wasser gespült und danach für 10 Minuten in eine Lösung aus 10 ml Formalin 20 % und 1g Hydrochinon in 90 ml Aqua dest. eingestellt. Im Anschluss wird in 3-mal gewechseltem dest. Wasser ausgewaschen.
Danach werden die Schnitte mit 1%iger Gold(III)chlorid Lösung für 5 Minuten überschichtet. Die Goldchlorid Lösung wird abgegossen und kann oft wiederverwendet werden.
Im Anschluss kurz in dest. Wasser spülen und danach in 2%ige Oxalsäure Lösung einstellen für mind. 5-10 Minuten. Jetzt sollten sich die Schnitte violett verfärben.
Danach kurz in Aqua dest ausspülen und für 5 Minuten in 5%ige Natriumthiosulfat Lösung einstellen. Im Anschluss über aufsteigende Ethanol Lösungen entwässern und über Xylol in Malinol/Histokitt eindecken.


d) Markscheidenfärbung n. Weil(1,7)

Zur Weil'schenFärbung dient eine Lösung aus 10 ml 1%igem Hämatoxylin und 90 ml Aqua dest., das mit ca. 20 mg Kaliumiodat versetzt wurde. DIe Lösung wird gut geschüttelt und im Anschluss unmittelbar vor der Färbung mit derselben Menge 4%iger Ammoniumeisen(III)-sulfat Lösung vermischt (für kleiner Mengen kann man die Stoffmengen entsprechend reduzieren). Die Schnitte werden für 30 Minuten bei 55 °C lichtgeschützt in dieser 1:1 Mischung aus Hämatoxylin und Ammoniumeisen(III)-sulfat belassen.

Im Anschluss werden die Schnitte in Leitungswasser abgewaschen bis keine Farbstoffwolken mehr abgehen. Danach werden sie in 4%ige Ammoniumeisen(III)-sulfatlösung eingestellt bis sich der mitgefärbte Hintergrund des Objektträgers völlig entfärbt hat. Danach wird in ausreichend Leitungswasser vorsichtig abgespült. Zur weiteren Differenzierung wird eine Lösung von 1 g Borax und 1,25 g Kaliumhexacyanidoferrat(III) verwendet. Die Differenzierung erfolgt unter mikroskopischer Kontrolle. Sobald nur noch die Markscheiden gefärbt sind wird die Differenzierung (nach ca. 1-5 Minuten) unterbrochen und die Schnitte in ausreichend Leitungswasser gespült. Im Anschluss werden sie noch in Leitungswasser eingestellt, dem wenige Tropfen Ammoniaklösung zugefügt wurden. Danach wird in Leitungswasser ausgespült und über die aufsteigende Ethanolreihe und Xylol entwässert und eingedeckt.


Entsorgung:
  • Ammoniakalische Silbernitrat Lösung in konzentrierte Ascorbinsäure eingießen und metallisches Silber regenerieren. Überschüssige Lösung kann auch zur Versilberung verwendet werden.
  • Formaldehydhaltige Abfälle getrennt sammeln und sachgerechter Altstoffsammlung zuführen.
  • Gold(III)chlorid Lösung in geringsten Mengen großteils wiederverwendbar, sonst mir reduzierter (!) ammonialkalischer Silbernitratlösung zum Schwermetallabfall. Eisenhämatoxlin, Kalimhexacyanoferrat und Borax alkalisieren und in den anorganischen Sondermüll.
  • Xylol und n-Butanol in den halogemfreienbLösungsmittelabfall.
  • Ethanol und Spiritus können in kleinen Mengen verdünnt dem Abwasser beigemengt werden, sonst im Lösungsmittelabfall

Ergebnis/Erklärung:

Bielschowsky Färbung:
Sehr schöne und scharfe Färbung der Neurofibrillen, das umliegende Gewebe wird bei Variante A gelblich gefärbt und liefert so einen sehr schönen Kontrast. Die Perikaryen färben sich (dunkel)braun. Bei Variante B durch das Tönen mit Goldchlorid Lösung ebenfalls schöne Darstellung der Neurofibrillen, das umliegende Gewebe wird jedoch grau und damit erzielt man meiner Meinung nach einen schlechteren Kontrast und man kann man sich die Goldchlorid Lösung sparen.
Bei der Bielschowsky Imprägnation könnte man die Schnitte natürlich auch in 20%ige Silbernitratlösung einstellen, die von mir in der feuchten Kammer beschriebene, umständlichere Methode dient nur dem Zweck Silbernitrat zu sparen. Wahrsacheinlich ist auch eine 10%ige Lösung und eine Einwirkzeit von 1 Stunde vollkommen ausreichend, es sind entsprechende Rezepte beschrieben, versucht habe ich sie noch nicht. Um die Schnitte herum bilden sich leider manchmal durch Verwendung von Glycerin-Eiweiß Niederschläge, die aber den Schnitt an sich kaum betreffen meiner Erfahrung nach und sich und um den Schnitt herum bilden.

Bodian Färbung:
Auch die Bodian Färbung ergibt eine schöne scharfe Darstellung der Neurofibrillen, der Hintergrund ungefärbt, die Perikaryen leiht violett mit dunkelvioletten Zellkernen. Damit ist die Methode kontrastreicher als die Bielschowsky B Variante. Leider ist Albumosesilber/Protargol schwer erhältlich und eher teuer.

Weil-Färbung:
Gut zu erkennen sind die myelinisierten blauen bis blau-grauen Nervenfasern. Das restliche Gewebe sollte weitgehend ungefärbt, maximal hellbraun gefärbt werden. Mit dieser Färbemethode könnten demyelinisierte Defektareale gut dargestellt werden.


Minimale neuroanatomische Grundlagen:

Das Großhirn (Telencephalon) besteht aus 2 miteinander verbundenen Hemisphären, weist Windungen (Gyri) und Gräben (Sulci) auf, wodurch die Oberfläche des Großhirns wesentlich vergrößert wird. Die Rinde lässt sich in graue und weiße Substanz unterteilen. Die Graue Substanz enthält die Nervenzellkörper (Perikaryen) und sitzt außen, die weiße Substanz enthält die Fortsätze der Nervenzellen, die sogenannten Axone. In der weißen Substanz eingelagerte Anteile grauer Substanz nennt man Kerne. Die graue Substanz lässt sich histologisch beim Menschen in 6 Schichten unterteilen, deren histologische Differenzierung nicht immer einfach ist.

Als ein exemplarisches, prominentes System gilt die Pyramidenbahn, die sämtliche willkürlichen Bewegungen steuert. Die Perikaryen der Pyramidenbahn (1. Motoneurone – große Pyramidenzellen) sitzen im Gyrus präcentralis des Frontallappen, deren Axone und setzen sich durch das Großhirn über den Hirnstamm fort. Zu 80% kreuzen die Fasern im verlängerten Mark auf die andere Seite und setzen sich dann ins Rückenmark fort, wo sie auf die 2. Motoneurone verschalten werden. Aus dem Rückenmark treten über die Spinalganglien schließlich aus dem Nervenplexus die peripheren Nerven aus die unsere Willkürmuskulatur versorgen. Neben der Pyramidenbahn gibt es eine Vielzahl anderer Bahnsysteme die für unsere körperlich-neurologische Steuerung (Sehen, Hören, Schmerzempfinden, …) essentiell sind und unsere gesamte Homöostase (Temperaturregulation, hormonelle Achsen, ...) steuern.

Das Kleinhirn lässt sich ebenfalls in Lappen unterteilen und hat eine große Anzahl von Funktionen. Eine zentrale Rolle spielt es an der Feinabstimmung von Bewegungen, sowie dem Gleichgewichtssinn. Es hat in diesem Sinne eine Feedbackfunktion zum Großhirn und erlaubt es dadurch Bewegungen zielgerecht zu steuern. Im Rahmen der Gleichgewichtskontrolle erhält das Kleinhirn sensorische Eingänge aus linkem und rechtem Gleichgewichtsorgan, verrechnet diese. Als zentraler Integrator kann das Kleinhirn bei Ungleichgewicht reflexartige Ausgleichsbewegungen initiieren. Die genauen Funktionen sind im Detail wesentlich komplexer und mannigfaltiger. Histologisch besteht es aus 3 Schichten gut abgrenzbaren Schichten, der Körnerzellschicht innen, der Purkinjezellschicht in der Mitte mit ihren langen Fortsätzen in die äußere Molekularschicht.

Die Axone der zentralen Nervenzellen besitzen eine Myelinschicht, die von den Oligodendrozyten gebildet wird. Die Myelinisierung der Fasern verläuft während der ersten Lebensjahre und dient als Isolation und verbessert die elektrische Leitfähigkeit. Die Myelinschicht ist deshalb von essentieller Bedeutung zur korrekten Leitfähigkeit der elektrischen Signale. Je dicker ein Axon myelinisiert ist, desto schneller leitet es. Bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS, die prominenteste die Multiple Sklerose (MS), wird durch autoimmunologische, entzündliche Prozesse die Myelinschicht zerstört. Folge der Demyelinisierung sind abgeschwächte und im weiteren Verlauf ausgefallene Leitfähigkeit, mit verschiedensten neurologischen Defektbildern.
Die Weil Färbung kann zwischen myelinisierten und demyelinisierten Fasern unterscheiden. MS Plaques würden sich darin nicht anfärben. Heutzutage wurde die Weil Färbung großteils durch die Luxol-Fast-Blue Färbung verdrängt, ist aber aus historischem Interesse und einfacherer Verfügbarkeit der Substanzen für diesen Artikel relevant. Da das hier verwendet Schweinegehirn keine demyelinisierende Erkrankung aufwies kann hier nur der physiologische Zustand demonstriert werden.


Bilder:
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medianer Querschnitt durch das Schweinegehirn nach Fixierung Großhirn um den Balken herum, hinten das Kleinhirn und nach unten Hinrstamm (Mittelhirn-Pons-Medulla oblongata bis zum Rückenmark)

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Die fertigen geschnittenen Blöchen der ZNS Strukturen.

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Entwässerung und Teile der Färbung, die Petrischale im Vordergrund als feuchte Kammer für die Beilschowsky Färbung.

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Querschnitt durch das Telencephalon - die Perikaryen sind hier nicht so stark gefärbt.

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Anschnitt durch das Kleinhirn, Weiße Substanz innen, graue Substanz außen, schön zu sehen die feine Aufteilung Arbor vitae genannt.

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Cerebellum - Bielschowsky Färbung Variante A - Übersicht

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Cerebellum - Bielschowsky Färbung Variante A - Detail; schön die Schichtung des Kleinhirns, ganz unten schwarz parallel verlaufende Axone der weißen Substanz, darüber die dichte Körnerzellschicht, darüber die selteneren aber großen Purkinjezellen und darüber die Molekularschicht. Die Körnerzellen (die einzig exizitatorischen, glutamergen neurone des Kleinhirns) erhalten Eingänge aus anderen ZNS Anteilen und geben efferente Fasern ab, die durch die Purkinjezellschicht durch in die Molkekularschicht laufen. Dort werden sie dann als Parallelfasern bezeichnet, da sie parallel zur Purkinjezellschicht laufen. Die so genannte Moosfasern enden an den Körnerzellen, die Kletterfasernd an den Purkinjezellen, sie verlaufen zwischen den Körnerzellen und bilden die afferenten Eingänge aus anderen Gehirn-/Rückenmarksabschnitten. In der Molekularschicht finden sich Korb- und Sternzellen.
Sehr schön zu sehen ist in diesem Schnitt der Verlauf der Parallelfasern der Korbzellen die parallel zu den Fasern der weißen Substanz laufen und rechtwinkelig zu den Fortsätzen der Purkinjezellen.


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Cerebellum - Bielschowsky Färbung Variante B, ähnlich zu beren Bild, der Kontrast bei weitem jedoch nicht so schön.


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Große Nervenzelle aus einem Kleinhirnkern - Bielschowsky Variante A


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Kleinhirn in der Bodian Färbung - hier fälschlicherweise die Schnittdicke nur 3 Mikrometer, weshalb die Fasersysteme nicht so eindrucksvoll erkennbar sind!


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Ausschnitt aus dem Hirnstamm, Ponsbereich mit Zahlreichen Faserverbindungen - Bielschowksy A.


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Ausschnitt aus dem Rückenmarksvorderhorn - Bielschowksy A - schön zu sehen die großen 2. Motoneurone an denen die Pyramidenbahn endet.


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Weil Färbung Cerebellum, die myelinisierte weiße Substanz am in der Bildmitte schön blau gefärbt, die Zellkerne der Körnerzellen ebenso, die graue Substanz ist kaum gefärbt.

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Hirnstamm in der Weil Färbung, die myelinisierten Faserverbindungen schön blau gefärbt, die graue Substanz ungefärbt.


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Übersicht ZNS einer Drosophila.


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Retinotope Anordnung der Nervenfasern vor Eintritt in das Komplexauge, auch hier chiasmatische Verschaltung der Neurone.


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Detailaufnahme aus dem ZNS einer Drosophila - Bielschowsky Variante B - Gegenfärbung mit Kernechtrot - bei allen Versilberungen sind fast alle Gegenfärbungen problemlos möglich.



Quellen:

1. Mulisch, M., & Welsch, U. (Hrsg.). (2015). Romeis - Mikroskopische Technik (19. Aufl.). Springer.
2. Bielschowsky’s silver stain protocol. (o. J.). Abcam.com. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://www.abcam.com/en-at/technical-r ... lver-stain
3. Juli, I. (o. J.). B O T A N I K P A R A S I T O L O G I E Z O O L O G I E. Waldeck-ms.de. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://www.waldeck-ms.de/wp-content/do ... eutsch.pdf
4. Histological methods for CNS. (o. J.). Pathologycenter.Jp. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://pathologycenter.jp/method-e/bodian.html
5. Method of the histochemical stains and diagnostic application - department of pathology and laboratory medicine - university of Rochester medical center. (o. J.). Rochester.edu. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://www.urmc.rochester.edu/urmc-lab ... RVEENDINGS
6. Histological methods for CNS. (o. J.). Pathologycenter.Jp. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://pathologycenter.jp/method-e/bodian.html
7. Weil’s myelin stain. (o. J.). Protocolsonline.com. Abgerufen 14. Oktober 2023, von https://www.protocolsonline.com/histolo ... lin-stain/
8. Eisner, A. (o. J.). Mikroskopische Färbemethoden, Farbstoffdaten, Fixiermittel, Rezepturen. Aeisner.de. Abgerufen 14. Oktober 2023, von http://www.aeisner.de/
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lemmi
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von lemmi »

WOW! Sehr beeindruckend! Das ist mikroskopische Färbetechnik der Spitzenklasse. Die Bilder sind fantastisch! Habe ich seit meinen Histologiekursen nicht mehr gesehen! Du wolltest doch Neurologe werden. Sicher, dass du nicht besser Neuroanatom oder Neuropathologe werden willst? :wink:

Zwei Fragen zu den eingesetzten Reagenzien:

1. handelt es sich beim Gold(III)-chlorid wirklich um AuCl3 und nicht doch um Tetrachlorogoldsäure H[AuCl4]? Bzw. weißt du, ob man auch Natrium-Gold-Chlorid, Na[AuCl4], einsetzen kann? Das wäre durch Neutralisieren von H[AuCl4] mit NaOH leicht zugänglich.
2. Was ist die Zusammensetzung des Protargols/Albumosesilbers? Soweit ich weiß war das in Deutschland zuletzt im DAB 6 (1926) aufgeführt, dort wird nur ein Mindestgehalt an Silber von 8 % gefordert, und dass es klar in Wassr löslich sein sollte. Welche Substanz hast du verwendet? Gibt es die für diese Färbungen noch immer käuflich zu erwerben, hast du auf hsitorische Bestände zurückgegriffen oder muss man sich die selbst herstellen?
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mgritsch
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von mgritsch »

:thumbsup: 8) Wow, das ist zwar nicht mein Fachgebiet, aber trotzdem in den Ergebnissen erkennbar ganz großes Kino! Und die ganze Aufbereitung ist auch extrem sauber und ausführlich. Dankeschön für die Mühe!
Alf
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von Alf »

Vielen Dank! :)
1. handelt es sich beim Gold(III)-chlorid wirklich um AuCl3 und nicht doch um Tetrachlorogoldsäure H[AuCl4]? Bzw. weißt du, ob man auch Natrium-Gold-Chlorid, Na[AuCl4], einsetzen kann? Das wäre durch Neutralisieren von H[AuCl4] mit NaOH leicht zugänglich.
Die Frage habe ich mir anfangs selbst auch gestellt, ich habe mühsam eine entsprechende Gold(III)chlorid Lösung hergestellt indem ich Goldfolie in dest. Wasser suspendiert habe und dadurch langsam Chlorgas geleitet, bis es sich vollständig aufgelöst hat, dann vorsichtig eingedampft und das feste Gold(III)chlorid wieder in dest. Wasser aufgelöst. Ob dadurch wirklich eine Gold(III)chlorid Lösung entstanden ist oder ob es in Wasser gelöst als Tetrachlorogoldsäure vorliegt kann ich nicht beantworten.

Aber, und das werde ich ergänzen, ich hätte mir das Ganze sparen können, man kann auch Tetrachlorogoldsäure verwenden. Vor vielen Jahren habe ich mal einen kleinsten "Wiener Philharmoniker" in Königswasser aufgelöst, die überschüssige Säure verdampft und vorsichtig unter Vakuum getrocknet. Die Daraus hergestellte Tetrachlorogoldsäure funktioniert als Lösung für das Tönen genauso gut (bzw. bei der Bielschowsky finde ich das Tönen sogar eher störend).
2. Was ist die Zusammensetzung des Protargols/Albumosesilbers? Soweit ich weiß war das in Deutschland zuletzt im DAB 6 (1926) aufgeführt, dort wird nur ein Mindestgehalt an Silber von 8 % gefordert, und dass es klar in Wasser löslich sein sollte. Welche Substanz hast du verwendet? Gibt es die für diese Färbungen noch immer käuflich zu erwerben, hast du auf hsitorische Bestände zurückgegriffen oder muss man sich die selbst herstellen?
Das von mir verwendete Protargol stammt aus einem Altbestand und bildet eine braune, aber klare Lösung in Wasser. Mehr als auf dem Fläschen vermerkt stand kann ich dazu auch nicht sagen. Als Protargol gibt es das heute von der Firma Bayer auch nicht mehr zu kaufen. Als Silberproteinat/Albumosesilber kann man es zumindest z.b. bei Sigma Aldrich(https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sial/05495) noch kaufen.
In der 6) Quelle https://pathologycenter.jp/method-e/bodian.html sind zumindest ehemalie Hersteller gelistet.
Laut Wikipedia ursprünglich von Arthur Eichengrün (https://de.wikipedia.org/wiki/Arthur_Eichengr%C3%BCn), lt. englischer Version auch zur Behandlung von Gonorrhoe, später vor allem zur Darstellung von Ciliaten.
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Uranylacetat
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von Uranylacetat »

WOW! :thumbsup: Ist zwar nicht mein Revier; doch ich schaue sehr gerne über Tellerränder. Und diese für mich interessanten sowie spannenden „mikroskopischen Einsichten“ ins Gehirn sind Dir 1A gelungen.

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lemmi
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von lemmi »

Alf hat geschrieben: Montag 16. Oktober 2023, 12:30 Als Protargol gibt es das heute von der Firma Bayer auch nicht mehr zu kaufen. Als Silberproteinat/Albumosesilber kann man es zumindest z.b. bei Sigma Aldrich(https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sial/05495) noch kaufen.
In der 6) Quelle https://pathologycenter.jp/method-e/bodian.html sind zumindest ehemalie Hersteller gelistet.
Laut Wikipedia ursprünglich von Arthur Eichengrün (https://de.wikipedia.org/wiki/Arthur_Eichengr%C3%BCn), lt. englischer Version auch zur Behandlung von Gonorrhoe, später vor allem zur Darstellung von Ciliaten.
Aha, das Präparat von Sigma entspricht scheinbar - jedenfalls was den Silbergehalt angeht - noch dem DAB 6.
Höchstwahrscheinlich ist das DAB 6-Präparat dasjenige von Bayer gewesen und wurde damit zum Standard. Im Untertitel zu Argentum proteinicum steht ausdrücklich "Protargol®". Es wurde ursprünglich tatsächlich als Antiseptikum entwickelt, speziell zur Therapie der Gonorrhoe. Dass es auch zu mikroskopischen Färbungen verwendet wird, wusste ich gar nicht. Ich hätte da "reaktivere" Verbindungen, wie das Diamminsilber, erwartet (das du ja auch verwendet hast).
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von lemmi »

Ich wüsste gerne noch was über die chemischen Vorgänge bei den Färbungen!

Welche Moleküle sind es, die die Nervenzellen/Axone sich so selektiv mit Silber anfärben lassen? Die Färbung beruht offenbar auf der Reduktion zu metallischem Silber. Warum benutzt man zuerst Silbernitrat Lösung und dann Silberdiamminnitrat?

Wie funktioniert die Färbung mit Albumosesilber? Meiner Erinnerung nach ist das ein kolloidales Silber mit Eiweiß-Schutzkolloid. Das dürfte keine chemische Reaktion eingehen sondern sich allenfalls physikalisch an die ( sub)-zellulären Strukturen binden, oder liege ich da falsch?

Das "Tonen" mit Goldsalzen beruht vermutlich darauf, dass Silber in Lösung geht und sich Gold abscheidet, so wie es vor 125 Jahren mit Photographien gemacht wurde, damit sie einen wärmeren, braunen Ton bekamen. Richtig? Was soll der Sinn davon in der Histochemie sein? Besserer Kontrast? Feinere Darstellung von Strukturen?

Die Markscheidenfärbung wäre auch noch eine Anmerkung wert. Die Färbelösung ist im Grunde eine Eisenhämatoxylinlösung: Hämatoxylin wird durch Kaliumiodat zu Hämatein oxidiert und bildet mit Fe3+-Ionen einen Farblack, der selektiv an saure Strukturen bindet ( Zellkerne--> DNA). Was die Zielmoleküle der Myelinscheiden sind wüsste ich gerne.
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Re: Neurohistologisch und neuroanatomische Methoden

Beitrag von lemmi »

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